Teknik Pembuatan Preparat Apus dan Pewarnaan Gram
Panduan Lengkap Mikrobiologi Dasar
Dalam dunia mikrobiologi, kemampuan untuk mengamati dan mengidentifikasi bakteri merupakan keterampilan fundamental. Karena bakteri merupakan organisme mikroskopis yang umumnya tidak berwarna dan transparan, pengamatan langsung tanpa pewarnaan akan sangat sulit dilakukan. Untuk mengatasi hal ini, digunakan teknik pembuatan preparat apus dan diikuti dengan pewarnaan, di mana pewarnaan Gram adalah salah satu teknik yang paling penting dan paling sering digunakan di laboratorium.
Dokumen ini akan membahas secara rinci langkah-langkah pembuatan preparat apus yang baik dan prosedur pewarnaan Gram untuk membedakan bakteri Gram positif dan Gram negatif.
Pengertian Preparat Apus
Preparat apus (smear) adalah lapisan tipis kultur mikroorganisme yang dibuat di atas objek glass (kaca benda). Tujuan utama pembuatan apusan adalah untuk merekatkan bakteri pada permukaan kaca agar tidak tercuci saat proses pencucian dan pewarnaan, serta mematikan bakteri agar tetap berada pada posisinya (fiksasi). Aplusan yang baik haruslah tipis, agar para bacteria tidak tumpuk tindih (overlap), sehingga memungkinkan pengamatan morfologi sel (bentuk, ukuran, dan pengelompokan) secara individual.
I. Alat dan Bahan
Sebelum memulai praktikum, pastikan semua alat dan bahan telah disiapkan di meja kerja.
| Alat | Bahan |
|---|---|
| Objek glass (kaca benda) | Kultur bakteri (murni) |
| Ose (loop jarum) bakteri | Aquadest (air suling) |
| Bunsen burner atau spiritus | Pewarna Kristal Violet (Cristal Violet) |
| Rak preparat/penahan kaca | Larutan Yodium (Lugol/Gram's Iodine) |
| Kertas tissue | Alkohol 95% (sebagai peluntur) |
| Mikroskop cahaya | Pewarna Safranin |
II. Teknik Pembuatan Preparat Apus
Keberhasilan pewarnaan sangat bergantung pada kualitas preparat apus. Berikut adalah langkah-langkah standar dalam membuat apusan bakteri:
Langkah 1: Sterilisasi Ose
Pertama, sterilisasikan ose dengan cara memanaskannya di nyala api Bunsen burner sampai ose menjadi berpijar (merah menyala). Biarkan sedikit mendingin sebelum menyentuh kultur bakteri untuk mencegah kematian bakteri karena panas berlebih dan menghindari uap air yang terbentuk saat bakteri diambil.
Langkah 2: Pengambilan Bakteri
Jika sumber bakteri berasal dari koloni pada media padat (seperti Agar Nutrien), bukalah cawan petri sedikit. Sentuh ujung ose yang sudah dingin ke permukaan koloni bakteri untuk mengambil sedikit sampel. Jika bakteri berada dalam media cair, celupkan ose ke dalam kultur bakteri.
Langkah 3: Membuat Aplusan di Objek Glass
- Untuk bakteri dari media padat: Letakkan setetes air suling di tengah objek glass. Masukkan bakteri yang sudah terambil ke dalam tetesan air tersebut, lalu aduk melingkar (gepeng) hingga merata di area kira-kira sebesar koin Rp1.000.
- Untuk bakteri dari media cair: Tidak perlu menambahkan air. Langsung taruh setetes cairan bakteri di objek glass dan ratakan.
Langkah 4: Pengeringan (Air Drying)
Biarkan preparat apus mengering secara alami di udara (air drying). Jangan mengeringkannya dengan cara dipanaskan langsung di atas api, karena akan membuat bakteri rusak morfologinya. Pastikan apusan benar-benar kering sebelum menuju tahap fiksasi.
Langkah 5: Fiksasi Panas (Heat Fixation)
Setelah kering, lakukan fiksasi untuk merekatkan bakteri ke kaca dan membunuhnya. Caranya dengan cara menggelindingkan objek glass di atas nyala api (seperti memanggang roti) sebanyak 2-3 kali cepat. Jangan dipanaskan terlalu lama karena bakteri bisa gosong atau hancur.
III. Teknik Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram dikembangkan oleh Hans Christian Gram pada tahun 1884. Teknik ini adalah pewarnaan diferensial yang membagi bakteri menjadi dua kelompok besar berdasarkan komposisi dinding selnya: Gram Positif dan Gram Negatif. Perbedaan ini terletak pada ketebalan lapisan peptidoglikan pada dinding sel.
Berikut adalah prosedur bertahap pewarnaan Gram pada preparat yang sudah difiksasi:
Langkah 1: Pewarnaan Utama (Kristal Violet)
Teteskan pewarna Kristal Violet ke permukaan preparat. Biarkan selama 1 menit. Bilas perlahan menggunakan air mengalir (bukan langsung di bawah keran yang kuat) sampai air bening kembali. Pada tahap ini, semua bakteri akan berwarna ungu.
Langkah 2: Penambahan Mordan (Larutan Yodium/Lugol)
Teteskan larutan yodium (Lugol) di atas preparat. Biarkan selama 1 menit. Yodium berfungsi sebagai mordan (pencatat warna) yang membentuk kompleks tidak larut dengan Kristal Violet di dalam sel bakteri. Bilas kembali dengan air mengalir sampai bersih.
Langkah 3: Pelunturan (Dekolorisasi dengan Alkohol 95%)
Ini adalah tahap paling krusial dalam pewarnaan Gram. Teteskan alkohol 95% (atau aseton-alkohol) secara hati-hati di atas preparat sambil mengoyang-goyangkan objek glass agar alkohol jatuh merata. Lakukan selama 5-10 detik saja (atau sampai air alkohol yang jatuh tidak lagi membawa warna ungu).
Cepat bilas dengan air mengalir untuk menghentikan proses pelunturan. Jika terlalu singkat, bakteri Gram negatif akan tetap terlihat ungu (fals positif). Jika terlalu lama, bakteri Gram positif akan kehilangan warna ungu (fals negatif).
Langkah 4: Pewarnaan Tanding (Safranin)
Teteskan pewarna penyangga/pewarna tanding Safranin. Biarkan selama 30 detik hingga 1 menit. Bilas dengan air mengalir sampai bersih. Safranin akan memberikan warna merah/pink pada bakteri yang telah kehilangan warna ungu (yaitu bakteri Gram negatif).
Langkah 5: Pengeringan dan Pengamatan
Keringkan preparat menggunakan kertas tissue dengan menepuk-nepuknya secara perlahan (jangan digosok agar bakteri tidak terkelupas). Tempatkan preparat di atas meja mikroskop. Amati dengan pembesaran kuat (misalnya 100x) menggunakan minyak imersi.
IV. Hasil Pengamatan dan Interpretasi
Setelah prosedur selesai, kita dapat membedakan bakteri berdasarkan warna yang ditampilkan di bawah mikroskop:
- Bakteri Gram Positif: Akan terlihat berwarna Ungu/Biru. Contoh bakteri: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, dan Bacillus cereus. Struktur dinding sel yang tebal menahan kompleks Kristal Violet-Yodium.
- Bakteri Gram Negatif: Akan terlihat berwarna Merah Muda (Pink) atau Kemerahan. Contoh bakteri: Escherichia coli, Salmonella typhi, dan Pseudomonas aeruginosa. Lapisan lipid yang tinggi pada dinding selnya larut oleh alkohol, sehingga warna ungu terlepas dan digantikan oleh Safranin.
Kesimpulan
Teknik pembuatan preparat apus dan pewarnaan Gram adalah metode dasar yang sangat vital dalam diagnostik mikrobiologi. Pembuatan apusan yang benar harus menghasilkan lapisan bakteri yang tipis dan menempel kuat agar tidak hilang saat pencucian. Pewarnaan Gram memanfaatkan perbedaan struktural dinding sel bakteri untuk membedakan dua golongan utama mikroorganisme.
Ketepatan waktu, terutama pada tahap pelunturan dengan alkohol, adalah kunci keberhasilan teknik ini. Hasil akhirnya memberikan informasi awal yang sangat besar mengenai identitas bakteri, yang akan membimjang langkah-langkah selanjutnya dalam pengobatan klinis atau penelitian ilmiah. Kesalahan dalam prosedur akan mengarah pada identifikasi yang salah, oleh karena itu ketelitian dan kesabaran adalah syarat mutlak dalam melakukan teknik ini.
Teknik Pembuatan Preparat Apus Dan Pewarnaan Gram dan Link Download File Referensi
KUNYIT (Curcuma Domestica Val) SEBAGAI PENGGANTI ZAT WARNA PRIMER PADA TEKNIK PEWARNAAN GR...
Pewarnaan Sederhana Dan Pewarnaan Diferensial dan Link Download File Referensi
PENGARUH PENUNDAAN PEMBUATAN PREPARAT APUSAN DARAH TEPI PADA SAMPEL EDTA TERHADAP MORFOLOG...